引物设计的原则

    引物设计有 3条基本原则：引物与模板的序列要严格互补；两条引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

    在引物的设计过程中，引物长度、产物长度、序列 Tm值、引物与模板形成双链的内部稳定性、形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation andhairpin）的能值、错配位点（false priming site）的引发效率、引物及产物的GC含量（composition）等均会对PCR反应效率产生影响，因此引物设计应遵循以下几个原则：

1.  引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

2.  引物序列在模板内（尤其是 3’端）应当没有相似性较高，否则容易导致错配。引物 3’端出现3个以上的连续碱基，如 GGG或 CCC，也会使错误引发的机率增加。

3.  引物 3’端的末位碱基对 Taq 酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错配效率明显高于其它 3个碱基，因此应当避免在引物的 3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR反

应失败。5’端序列对 PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

4.  引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5.  引物所对应模板位置序列的 Tm值在 72℃左右可使复性条件*佳。Tm值的计算有多种

方法， 如按公式 Tm＝4(G+C)＋2(A+T)， 在 Oligo软件中使用的是*邻近法。

6.  ∆G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定

性。应当选用 3’端 ∆G 值较低（**值不超过 9） ，而 5’端和中间 ∆G 值相对较高的引

物。引物的 3’端的 ∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。 

7.  引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且

降低引物有效浓度会使 PCR 反应不能正常进行。

8.  对引物的修饰一般是在 5’端增加酶切位点，应根据载体的相应序列而确定。

    值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的 PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。