实验目的
1、掌握*常用的提取质粒DNA的方法和检测方法;
2、了解制备原理及各种试剂的作用。
实验原理 碱裂解法是一种应用*为广泛的制备质粒DNA的方法,碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢DNA键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
**质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前*常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,本实验采用碱裂解法提取质粒DNA
一、材料
含pUC19质粒的大肠杆菌,1.5ml塑料离心管, 离心管架,枪头及盒、卫生纸。
二、设备
微量移液器(20μl,200μl,1000μl), 台式高速离心机,恒温振荡摇床, 高压蒸汽**器(**锅), 涡旋振荡器,恒温水浴锅,双蒸水器,冰箱,等。
三、试剂准备
1、 LB液体培养基:称取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5g,NaCl 10g,溶于800ml蒸馏水中,用NaOH调pH至7.5,加水至总体积1升,高压下蒸气**15分钟。
2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液:配成 100mg/ml水溶液,-20℃保存备用。
3. 溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0)。
配制方法:1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml,0.5M EDTA(pH 8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml。在121℃高压**15min ,贮存于4℃。
4. 溶液Ⅱ:0.2M NaOH,1% SDS。
配制方法:2M NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加ddH2O至10ml。使用前临时配置。
5. 溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 4.8。
配制方法:5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
6. 苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。【生物秀 www.bbioo.com】
7. 无水乙醇;
8. 70%乙醇;
9. TE:10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0)。
配制方法:1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml,0.5M EDTA(pH 8.0)0.2ml,加ddH2O至100ml。121℃高压湿热**20min,4℃保存备用。
1M Tris Cl(Tris(三羟甲基)氨基甲烷):800ml H2O中溶解 121g Tris碱,用浓盐酸调pH值,混匀后加水到1L;
0.5M EDTA(乙二胺四乙酸):700ml H2O中溶解186.1g Na2EDTA.2H2O,用10M NaOH调 pH8.0(需约50ml), 补H2O到 1L。
10. RNA酶A母液:将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
四、操作步骤
1. 挑取LB固体培养基上生长的单菌落,接种于20ml LB(含Amp100ug/ml)液体培养基中,37℃、250rmp振荡培养过夜(约12-14hr)。
2. 取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,12000rmp离心1-2min。弃上清,将离心管倒置于卫生纸上,使液体尽可能流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡,使菌体分散混匀。),室温下放置5-10 min。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5 min,使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清)。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置5min。 12000rmp离心10min。溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇,振荡混匀, 12000rmp离心10min。(450μl的苯酚/氯仿/异戊醇。)
7、小心移出上清于一新微量离心管中,加入2倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置 2-5min,离心12000rmp×10min。
8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次,12000rmp离心5 min。
9、 吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0,含20μg /ml RnaseA,约4μl)中,37℃水浴30min以降解RNA分子,储于-20℃冰箱中。
五 实验结果:
注意事项
1. 提取过程应尽量保持低温。
2. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。